Na początku XVI w. sytuacja religijna związana była ze stykaniem się katolicyzmu oraz prawosławia na ziemiach polskich. Na ziemiach Rzeczpospolitej Obojga Narodów mieszkali również Tatarzy wyznający islam oraz Żydzi będący judaistami. W 1518 r. na ziemie polskie przybyli również pierwsi luteranie. Zamieszkali oni obszar Gdańska, Torunia oraz innych miast na Pomorzu i w Wielkopolsce. Oficjalnie Zygmunt Stary zakazał zmiany wyznania z katolickiego na luterańskiego. Niemniej był to zakaz jedynie teoretyczny, bowiem w praktyce nie prześladowano protestantów. 

Za rządów Zygmunta II Augusta wielu szlachciców zmieniło wyznanie z katolickiego na kalwińskie, które przyjęła około 1/6 szlachty. Najwięcej zborów powstało w Małopolsce oraz na Litwie. W latach 60. XVI w. część kalwinistów odłączyła się i utworzyła wyznanie zwane arianizmem (bracia polscy).